Введение
Колибактериоз в птицеводстве является серьезной проблемой, снижающей продуктивность и эффективность отрасли в целом [4]. В общей инфекционной патологии птиц колибактериоз занимает первое место [7]. Падеж птицы достигает 70% от всей птицы, павшей от зарегистрированных заболеваний.
Кишечная палочка (Esсherichia coli) относится к условно-патогенным микроорганизмам, которые свое негативное влияние на птицу оказывают только при определенных условиях: приобретение дополнительных генов вирулентности бактерией, снижение иммунных свойств организма). Проблема отягощается появлением и распространением у бактерий генов, определяющих резистентность к используемым антибиотикам [1].
Именно поэтому тема бесконтрольного применения этих препаратов периодически поднимается на всех уровнях. В частности, сейчас антибиотики не используются в профилактических целях, их применяют только для терапии уже возникших заболеваний. Тем не менее, в сельском хозяйстве антибиотики иногда добавляют в корма с целью повышения продуктивности животных. Такое применение препаратов способствует появлению антибиотикорезистентных штаммов разных видов бактерий, которые при этом могут передавать это свойство друг другу [3].
Часто колибактериоз является секундарной инфекцией, которая развивается при поражении птицы другими [2].
Кишечная палочка, помимо генов резистентности, может нести и гены вирулентности, комбинация которых определяет клинические признаки и тяжесть заболевания. Эти бактериальные штаммы несут угрозу не только птице, но и другим животным и человеку [8].
Выявление генов резистентности к разным группам антибиотиков традиционно проводится с использованием коммерчески доступных индикаторных дисков [7]. В последние годы стали применять молекулярно-генетические методы, в частности, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для её использования проводится конструирование праймеров, которые специфически амплифицируют участки этих генов, делая их видимыми при разделении фрагментов ДНК в агарозном гель-электрофорезе, либо при проведении реал-тайм ПЦР.
Материалы и методы
Изоляты кишечной палочки выделялись из смывов клоаки 35-дневных индюшат создаваемого среднего кросса (отцовская линия – образцы 1–10, материнская линия – образцы 11–20), разных органов павших особей – образцы 1–10. Предварительное изучение культуральных и биохимических свойств и использование дифференциально-диагностических сред позволило идентифицировать выращенные бактерии на видовом уровне как кишечную палочку.
Бактериальная культура в жидкой среде осаждалась центрифугированием при 3000 об/мин на микроцентрифуге. Полученный клеточный осадок суспендировали в буфере TES (50 мМ Трис-HCL, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, pH 8.0). Для частичного разрушения клеточной стенки бактерий суспензию инкубировали с лизоцимом в течение 30 минут при 37 °С.
Окончательный лизис клеточной стенки достигался применением детергента додецилсульфат натрия, который вносился до конечной концентрации 1%. Лизис клеток сопровождался просветлением суспензии и появлением вязкости раствора вследствие освобождения ДНК. Очистка последней от примесей проводилась с использованием фенольно-хлороформенной экстракции, осаждения ДНК изопропиловым спиртом, отмыванием препарата 70° этанолом.
Чистая ДНК растворялась в дистиллированной воде и хранилась при температуре 4 °С. Количество и качество выделяемой ДНК оценивали в спектрофотометре NanoDrop 2000™.
Выявление генов резистентности проводили с помощью метода ПЦР со специфическими праймерами к участкам генов TetB и TetG (тетрациклин). Последовательности этих праймеров и условия реакции представлены в таблице 1.
| Наименование праймера | Последовательность нуклеотидов | Температура/время отжига | Температура/время элонгации |
|---|---|---|---|
| TetG прямой | GCTACATCCTGCTTCGCT | 55°C/15 сек. | 72°C/15 сек. |
| TetG обратный | CATAGATCGCCTGCTAGAAG | 55°C/15 сек. | 72°C/15 сек. |
| TetB прямой | CCTCAGCTTCTCAACCGCGTG | 60°C/15 сек. | 72°C/15 сек. |
| TetB обратный | GCACCTTGTCTGATGACTCTT | 60°C/15 сек. | 72°C/15 сек. |
Первоначальная денатурация проводилась в течение 5 минут для активации фермента (HotStart полимераза), окончательная элонгация также проводилась в течение 5 минут. Количество циклов составляло 30.
После проведения амплификации продукты амплификации разделяли по размеру в агарозном геле в присутствии флуорохрома бромид этидия. Напряжение постоянного тока устанавливали 120В в течение 2 часов. По окончании электрофореза гель помещали в систему гель-документации и производили фотографирование результатов.
Результаты исследования
Проведение ПЦР привело к формированию четко различимых фрагментов ДНК, показывающих наличие генов резистентности как у бактерий от здоровых индеек, так и павших. Размер амплификата гена TetB составил около 200 пар оснований ДНК [Рис. 1], а гена TetG – около 700 пар оснований [Рис. 2]. Размер амплификата определяли по программе в системе гель-документации по известным длинам фрагментов в маркерной ДНК.
Рис. 1. Гены резистентности TetB в изолятах кишечной палочки, выделенной из индюшат
(1–10 материнская линия создаваемого среднего кросса; 11-20 отцовская линия создаваемого среднего кросса; 21-30 — патологический материал из разных органов павших индюшат)
Рис. 2. Гены резистентности TetG в изолятах кишечной палочки, выделенной из индюшат
(1–10 материнская линия создаваемого среднего кросса; 11-20 отцовская линия создаваемого среднего кросса; 21-30 — патологический материал из разных органов павших индюшат)
Присутствие генов резистентности у бактерий от здоровой птицы и от павших особей свидетельствует о широком распространении генов (горизонтальный перенос генов) и возможности их передачи между особями при совместном содержании.
Заключение
Таким образом, ПЦР доказала широкое распространение у кишечной палочки генов устойчивости к тетрациклину, что подтверждается ранее полученными результатами по использованию индикаторных дисков [7]. Данное наблюдение еще раз подчеркивает необходимость строгого контроля над использованием в комбикормах антибиотиков тетрациклинового ряда.
Благодарности
Работа поддержана бюджетным финансированием по теме под номером госрегистрации 121021600202–7.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
- Давидович Н. В. Основные принципы эволюции антибиотикорезистентности у бактерий (обзор литературы) / Н. В. Давидович, Н. Н. Кукалевская, Е. Н. Башилова, Т. А. Бажукова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2020. – Т. 65. – № 6. – С.387‑393.
- Лаишевцев А. И. Клиническое исследование комбинированного коли-сальмонеллезного бактериофага на индейках / А. И. Лаишевцев, П. Н. Шастин, Э. Р. Зулькарнеев, В. А. Савинов, А. В. Хабарова, А. В. Капустин // Ветеринария и кормление. –2022. – № 6. – С. 51‑54. DOI: 10.30917/ATT-VK-1814‑9588‑2022‑6‑13.
- Новикова О. Б. Контроль бактериальных болезней на индейководческих предприятиях / О. Б. Новикова, М. А. Павлова // Птица и птицепродукты. – 2017. – № 6. – С. 22‑24.
- Нуралиев Е. Р. Лечебно-профилактические мероприятия при колибактериозе в промышленном птицеводстве / Е. Р. Нуралиев, К. Ж. Кушалиев // Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии. – 2021. – № 2. – С.51‑57. DOI: 10.12737/44171
- Рузина А. В. Ассоциированное течение сальмонеллеза и колибактериоза у птицы в условиях промышленного выращивания / А. В. Рузина, Н. В. Васюков, Т. Н. Рождественская, С. В. Панкратов // Птица и птицепродукты. – 2023. – № 1. – С. 49‑52. DOI: 10.30975/2073‑4999‑2023‑25‑1‑49‑52.
- Шестаков В. А. Патоморфология печени кур при сочетанном течении эшерихиоза и сальмонеллёза / В. А. Шестаков // Ветеринарный врач. – 2016. – № 5. – С.13‑16.
- Щепеткина С. В., Новикова О. Б., Забровская А. В., Терлецкий В. П., Тыщенко В. И. Современные принципы антибиотикотерапии в птицеводстве / С. В. Щепеткина, О. Б. Новикова, А. В. Забровская, В. П. Терлецкий, В. И. Тыщенко // Изд-во ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ», Санкт-Петербург 2015, 160 с.
- Stromberg Z. R. Evaluation of Escherichia coli isolates from healthy chickens to determine their potential risk to poultry and human health. / Z. R. Stromberg, J. R. Johnson, J. M. Fairbrother, J. Kilbourne, A. Van Goor, R. Curtiss Rd, M. Mellata // PLoS One. – 2017. – 12 (7): e0180599. DOI: 10.1371/journal.pone.0180599.
Авторы:
В. П. Терлецкий, доктор биологических наук, профессор, старший научный сотрудник, селекционно-генетический центр «Северо-Кавказская зональная опытная станция по птицеводству» – филиал ФГБНУ ФНЦ «ВНИТИП» РАН, Ставропольский край, Россия
Л. А. Шинкаренко, кандидат сельскохозяйственных наук, заместитель директора по науке, селекционно-генетический центр «Северо-Кавказская зональная опытная станция по птицеводству» – филиал ФГБНУ ФНЦ «ВНИТИП» РАН, Ставропольский край, Россия
Е. С. Овчарова, кандидат ветеринарных наук, заведующая отделом микробиологии, «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» – филиал ФГБНУ ФНЦ «ВНИТИП» РАН, Санкт-Петербург, Ломоносов, Россия
В. И. Тыщенко, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» – филиал ФГБНУ ФНЦ «ВНИТИП» РАН, Санкт-Петербург, Ломоносов, Россия
Источник: Журнал БИО