Вакцина с химерными вирусоподобными частицами, подобными вирусу гриппа H5, вызывает более широкую кросс-кладную гуморальную реакцию у кур, чем у уток

1. Введение

Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (HPAI) вызывают высокую смертность среди курообразных птиц. С 1996 г. евразийская линия A/гусь/Гуандун/1/1996 (Gs/GD) HPAI H5Nx вызывала вспышки среди домашних и диких птиц по всему миру, за исключением Антарктики и Австралии. Вирус HPAI линии Gs/GD эволюционировал независимо в 10 генетических и антигенно дивергентных клад (клады от 0 до 9) и их субклад, что затрудняет контроль над ними с помощью вакцинации домашней птицы. В то время как вирусы клады 2 широко распространились и преобладали среди домашней птицы, проживающей в большей части мира с 2005 г., вирусы клады 1 оставались преобладающими в Юго-Восточной Азии. Кроме того, непрерывные инфицирования людей вирусами HPAI H5 линии Gs/GD в энзоотических регионах часто приводили к летальному исходу и вызывали опасения по поводу потенциальных пандемий среди людей.

Для снижения экономических потерь в птицеводстве и риска заражения человека вакцинация домашней птицы против HPAI H5 широко применяется в различных энзоотических регионах, включая Китай, Египет, Индонезию и Вьетнам. Однако современные вакцины имеют существенное ограничение, заключающееся в том, что они не могут вызывать гуморальную реакцию широкого спектра действия против различных клад вирусов HPAI H5.

Антигенное соответствие между вакцинным штаммом и локально циркулирующим вирусом является решающим фактором в достижении оптимальной эффективности вакцины и сдерживании распространения вирусов HPAI H5. Действительно, сообщалось, что вспышка антигенно отличающихся штаммов HPAI H5 у вакцинированной домашней птицы вызывала высокую заболеваемость и смертность, несмотря на вакцинацию. Снижение эффективности вакцин также экспериментально продемонстрировано в исследованиях гетерологического заражения с использованием кур и домашних уток, что требует разработки вакцин, обеспечивающих широкую защиту от различных клад вирусов H5.

Домашние утки играют решающую роль в поддержании и передаче вирусов HPAI H5 различным видам носителей, включая домашнюю и дикую птицу. Учитывая их значительный вклад в эпидемиологию HPAI, крайне важно снизить риск заражения вирусом домашних уток посредством вакцинации, чтобы контролировать распространение HPAI. Антигенно совместимая вакцинация доказала свою эффективность в защите домашних уток от инфекции и клинических признаков после заражения гомологичным вирусом HPAI H5. Однако разработанные в настоящее время вакцины показали субоптимальную защитную эффективность у домашних уток, что привело к заболеваемости, смертности и длительному выделению вируса при заражении антигенно отдаленными вирусами HPAI H5. Несмотря на важность вопроса, вакцины, направленные на обеспечение более широкого иммунитета домашних уток против антигенно далеких клад вирусов HPAI H5, не разрабатывались.

Вирусоподобные частицы (ВПЧ), которые напоминают инфекционные вирусные частицы по структуре и морфологии, были предложены в качестве нового поколения вакцин против различных вирусов, включая различные вирусы гриппа A. В частности, было показано, что химерные ВПЧ гриппа, содержащие гемагглютинины (HA), полученные из нескольких подтипов вирусов гриппа, обеспечивают защиту от нескольких подтипов вирусов гриппа и у хорьков. Недавно Kang et al. также продемонстрировали защитную эффективность химерных ВПЧ гриппа, экспрессирующих гемагглютинины клады 2.3.2.1c и клады 2.3.4.4c вирусов HPAI H5 у кур. Однако потенциал химерных ВПЧ гриппа не был продемонстрирован на домашних утках.

В этом исследовании мы создали химерные ВПЧ, одновременно экспрессирующие антигенно удаленные гемагглютинины из клад 1 и 2 вирусов HPAI H5, используя бакуловирусную систему экспрессии (БЭС). Наша цель состояла в том, чтобы исследовать усиленные гуморальные реакции, вызванные химерными ВПЧ против четырех антигенно далеких клад вирусов HPAI H5N1. Мы провели наши исследования на двух основных видах домашней птицы: курах и утках.

2. Материалы и методы

2.1. Образование рекомбинантных бакуловирусов

Для клонирования полноразмерного гена гемагглютинина вируса H5N1 клад 1 был химически синтезирован ген гемагглютинина вируса A/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (Bioneer, Республика Корея) без последовательности многоосновного сайта расщепления (MBCS). Для клонирования полноразмерного гена гемагглютинина вируса H5N1 клады 2 вирусную РНК экстрагировали из A/мандаринка/K10–483/2010 (H5N1, клада 2.3.2.1), ген гемагглютинина амплифицировали, и многоосновной сайт расщепления был удален, как описано ранее. Амплифицированный ген гемагглютинина вируса клады 1 или клады 2 был клонирован в вектор pFastBac1 (Thermo Fisher, США), а полученные плазмиды были обозначены как pFast_clade1 и pFast_clade2, соответственно.

Другой pFastBac1, одновременно содержащий оба гена гемагглютинина вирусов H5N1 клады 1 и 2, был сконструирован путем клонирования расщепленного SnaBI/HpaI фрагмента pFast_clade 2 в расщепленный сайт HpaI из pFast_clade 1, и полученная плазмида была обозначена как pFast_clade 1 + 2. Плазмида, содержащая ген матрикса1 (M1) гриппа, обозначенная как pFast_M1, была сконструирована путем клонирования полноразмерного гена M1 A/Пуэрто-Рико/8/1934 (H1N1) в пустой вектор pFastBac1.

Используя pFast_clade 1, pFast_clade 2, pFast_clade 1+2 и pFast_M1, рекомбинантный бакуловирус (rBV), кодирующий ген гемагглютинина клады 1, ген гемагглютинина клады 2, гены гемагглютининов клады 1 и клады 2 или ген матрикса1 гриппа, был получен с использованием бакуловирусной системы экспрессии Bac-to-Bac (Thermo Fisher), и полученные рекомбинантные бакуловирусы (rBV) были обозначены как rBV_clade 1, rBV_clade 2, rBV_clade 1 + 2 или rBV_M1, соответственно (рис. 1А). Титры rBV измеряли стандартным методом бляшек с использованием клеток насекомых — Spodoptera frugiperda (Sf9).

2.2. Образование и характеристика H5 ВПЧ и приготовление ВПЧ-вакцин

Для создания клады 1 H5 ВПЧ клетки Sf9 инфицировали совместно rBV_clade1 и rBV_M1, оба при множественности заражения (MOI) равных 5. Для создания клады 2 H5 ВПЧ клетки Sf9 инфицировали совместно rBV_clade2 и rBV_M1, оба при MOI равной 5. Для производства химерных H5 ВПЧ клетки Sf9 инфицировали совместно rBV_clade 1 + 2 и rBV_M1, оба с MOI равной 5.

Через 72 часа после заражения собирали культуральную среду, содержащую ВПЧ (рис. 1B), и осветляли низкоскоростным центрифугированием (2000×g, 30 мин, 4 °C) для удаления крупных клеточных остатков, а ВПЧ из осветленных супернатантов осаждали (30000×g, 1,5 ч, 4 °C). Осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, pH=7,2), загружали в прерывистый градиент плотности сахарозы 20–50% (масса/объем) и ультрацентрифугировали (150 000 × g, 1,5 ч, 4 °C) для очищения. Полосы, расположенные выше 50% плотности сахарозы, собирали. Концентрацию общего белка в каждом препарате H5 ВПЧ определяли количественно с помощью набора для анализа белков Bradford (Pierce, США).

Экспрессию гемагглютининов клад 1 и 2, а также белков М1 в каждом препарате ВПЧ определяли с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиного моноклонального антитела против клады 1 Н5 (Median Diagnostics, Республика Корея), мышиного моноклонального антитела против клады 2 Н5 (Bionote, Республика Корея), и кроличьего поликлонального антитела против М1 (Immune Technology, США). Наличие ВПЧ наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с использованием метода негативного окрашивания. Вакцины H5 ВПЧ с конечными концентрациями 40 мкг ВПЧ/0,5 мл на дозу получали путем эмульгирования каждой коллекции H5 ВПЧ в масляном адъюванте Montanide ISA70 (SEPPIC, Франция) в соотношении 30:70 (объем к объему).

2.3. Иммунизация животных и определение серологических реакций иммунитета

В общей сложности 30 SPF цыплят породы белых леггорнов в возрасте 6 недель (Namduck Sanitec, Республика Корея) и 30 коммерчески доступных пекинских уток в возрасте 5 недель были разделены на 3 соответствующие группы (по 10 кур в группе и 9–10 уток в группе). Каждую группу кур или уток внутримышечно иммунизировали дважды (с интервалом в три недели) вакцинами клады 1, клады 2 или химерными H5 ВПЧ (0,5 мл на голову). Все животные были подтверждены на серонегативность перед иммунизацией с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) против различных ветвей вирусов H5N1.

Для определения серонегативности животных до иммунизации и сероконверсии после иммунизации у кур и уток, вакцинированных ВПЧ, до иммунизации и через 3 недели после каждой иммунизации собирали сыворотки для кросс-кладного метода РТГА с использованием вирусов H5N1 из разных клад. Вирусы H5N1, содержащие гены гемагглютинина (HA), без последовательностей многоосновного сайта расщепления (MBCS), A/Вьетнам/1194/2004 (клада 1), A/Индонезия/5/2005 (клада 2.1), A/мандаринка/K10–483/2010 (клада 2.3.2.1) или A/курица/Корея/ES/2003 (клада 2.5), были созданы с использованием системы обратной генетики (RG). РТГА проводились в соответствии со стандартами Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ) с использованием 4 единиц гемагглютинина от вирусов H5N1. Для устранения неспецифических факторов РТГА 1 объем утиной сыворотки обрабатывали 3 объемами фермента, разрушающего рецепторы, при 37 °C в течение 16 ч с последующей тепловой инактивацией в течение 30 мин при 56 °C.

2.4. Статистический анализ

Критерий Данна для множественного сравнения использовали после критерия Краскела-Уоллиса (непараметрический аналог однофакторного дисперсионного анализа) для сравнения титров РТГА между группами (т. е. клада 1 ВПЧ против клады 2 ВПЧ против химерных ВПЧ). Непараметрический критерий U-Манна-Уитни использовали для сравнения титров РТГА между двумя группами (т. е. первичная иммунизация против бустерной или курица против утки). Титр РТГА равный 2 был присвоен образцам с необнаруженной активностью РТГА для статистического анализа. Для статистического анализа использовали логарифмически преобразованные (по основанию 2) титры РТГА. Результаты со значениями p<0,05 считались статистически значимыми.

2.5. Заявление об этике

Все методики, выполненные на животных в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по заботе и использованию животных (IACUC) Университета Конкук.

3. Результаты

3.1. Образование и характеристика химерных H5 ВПЧ

Наблюдалось высвобождение в культуральные супернатанты химерных H5 ВПЧ, содержащих гемагглютинины как клады 1, так и клады 2 (рис. 1C-E). Вестерн-блоттинг-анализ показал наличие H5 гемагглютининов как клады 1 (рис. 1C), так и клады 2 (рис. 1D) из химерной ВПЧ, в то время как стандартные ВПЧ содержали только гемагглютинин клады 1 или гемагглютинин клады 2, как и ожидалось. Белки матрикса были обнаружены на сопоставимых уровнях между ВПЧ (рис. 1C, D). Размер частиц ВПЧ составлял примерно 100 нм в диаметре, а морфология напоминала вирион гриппа с шипами на поверхности (рис. 1Е). Эти результаты подтверждают успешное получение химерных ВПЧ.

3.2. Гуморальная реакция у кур

Химерные ВПЧ вызывали более широкую гуморальную иммунную реакцию против нескольких вирусов HPAI H5 из разных клад по сравнению с моновалентными ВПЧ (рис. 2A, F). Как первичная, так и бустерная иммунизация химерными ВПЧ индуцировала значительно более высокие антитела при РТГА против клады 1 (рис. 2B, G) и клады 2.3.2 (рис. 2D, I) вирусов H5N1 по сравнению с каждой стандартной ВПЧ.

Например, уровни антител против клады 1, индуцированные химерными ВПЧ, были значительно выше, чем уровни, индуцированные моновалентными ВПЧ клады 2.3.2, и сопоставимы с уровнями, индуцированными моновалентными ВПЧ клады 1 (рис. 2B, G). В то время как гуморальная реакция была умеренной против вирусов клады 2.1 (рис. 2C, H) и клады 2.5 (рис. 2E, J), которые отличаются от гемагглютининов клад, включенных в химерные ВПЧ, химерные ВПЧ индуцировали значительно более высокие антитела против клады 2.5 по сравнению с индуцированной моновалентной кладой 2.3.2 ВПЧ, как после первичной, так и после бустерной иммунизации. Эти данные показывают, что химерные ВПЧ индуцируют более широкий гуморальный ответ против множественных вирусов HPAI H5 из различных ветвей по сравнению с моновалентными ВПЧ.

3.3. Гуморальная реакция у уток

Подобно результатам, полученным на курах, химерные ВПЧ вызывали у уток более широкую гуморальную реакцию против нескольких вирусов HPAI H5 по сравнению с моновалентными ВПЧ (рис. 3A, F). После первичной и бустерной иммунизации химерные ВПЧ индуцировали значительно более высокие титры антител РТГА против клады 1 (рис. 3B, G) и клады 2.3.2 (рис. 3D, I) вирусов H5N1 по сравнению с каждой моновалентной ВПЧ.

Например, уровни антител против клады 1, индуцированные химерными ВПЧ, были значительно выше, чем уровни, индуцированные моновалентными ВПЧ клады 2.3.2, и сравнимы с уровнями, индуцированными моновалентными ВПЧ клады 1 (рис. 3B, G). Химерные ВПЧ индуцировали более высокие средние титры антител РТГА против клады 2.1 (рис. 3C, H) и клады 2.5 (рис. 3E, J) вирусов H5N1 по сравнению с каждой моновалентной ВПЧ. В частности, химерные ВПЧ индуцировали значительно более высокие уровни антител против клады 2.1, а также против клады 2.5 по сравнению с моновалентными ВПЧ клады 1 после бустерной иммунизации (рис. 3H, J). Эти данные свидетельствуют о том, что химерные ВПЧ могут индуцировать более широкий гуморальный ответ по сравнению с моновалентными ВПЧ у уток, что соответствует результатам, полученным на курах. Однако индукция перекрестно-реактивных антител против гетерологичных гемагглютининов (т. е. клады 2.1 и вклады 2.5) была ниже, чем у кур.

3.4. Сравнение гуморальных реакций у кур и уток

Гуморальная реакция у уток была значительно более ограниченной и ниже, чем у кур, на протяжении всего исследования, независимо от используемых ВПЧ и количества иммунизаций. За исключением антител РТГА против гемагглютининов клады 2.5, у уток наблюдались значительно более низкие уровни гуморального ответа, чем у кур после первичной иммунизации моновалентными ВПЧ клады 1 или клады 2 (рис. 4A, B) и химерными ВПЧ (рис. 4C). Различия были еще больше после бустерной иммунизации. Во всех четырех кладах гемагглютининов у уток генерировался значительно более низкий уровень гуморальной реакции по сравнению с курами, независимо от используемых ВПЧ (рис. 4D-F). В то время как бустерная иммунизация значительно расширила кросс-кладный гуморальный ответ у кур (рис. 5A-C), этот эффект не наблюдался у уток, которые не показали какого-либо увеличения гуморальной реакции при бустерной иммунизации (рис. 5D-F).

4. Обсуждение

В этом исследовании мы разработали химерную ВПЧ-вакцину против гриппа, содержащую гемагглютинины из двух разных клад вирусов HPAI H5, и провели сравнительную оценку потенциального использования вакцины у кур и уток против глобально циркулирующих вирусов HPAI H5 евразийского происхождения.

Наша химерная ВПЧ-вакцина H5, включающая гемагглютинины из клад 1 и 2 вирусов HPAI H5N1, индуцировала более выраженные антитела при РТГА у кур и домашних уток, чем моновалентные ВПЧ, что указывает на возможность широкой защитной эффективности против различных ветвей вирусов HPAI H5.

Мы также показали, что гуморальная реакция на ВПЧ у уток была значительно более ограниченной и ниже, чем у цыплят, и независимо от типа используемых антигенов и количества иммунизаций, что позволяет предположить, что потребуются более совершенные вакцины или стратегии вакцинации для выявления широкого и надежного гуморального ответа у уток. Хотя это исследование успешно продемонстрировало потенциал технологии химерных ВПЧ для расширения гуморальной реакции на несколько клад вирусов HPAI H5 у кур и уток, существует несколько ограничений.

Во-первых, наше сравнение количества антител у кур и уток было основано исключительно на РТГА. Хотя титры РТГА обычно хорошо коррелируют с титрами нейтрализующих антител и широко используются в качестве индикаторов защиты от гриппа, важно учитывать, что разные виды могут демонстрировать разные уровни нейтрализующих антител, несмотря на одинаковые титры РТГА. Хотя это исследование не включало анализы нейтрализации, возможно, что такие анализы могли бы обеспечить более высокую чувствительность при оценке уровня защитных антител у иммунизированных животных и служить более лучшими предсказателями расширенной защитной эффективности химерных ВПЧ по сравнению с анализами РТГА.

Во-вторых, отсутствие экспериментов с контрольным заражением в этом исследовании не позволяет нам определить, приведут ли относительно низкие титры РТГА антител у уток к более низким уровням защиты от вирусов HPAI H5 у уток по сравнению с курами. Защита от вирусных инфекций определяется не только ранее существовавшим иммунитетом, но также зависит от противовирусных реакций носителя и восприимчивости носителей к различным вирусным штаммам, что является факторами, которые эволюционно различают кур и уток.

Например, было показано, что RIG-I (тип внутриклеточных рецепторов опознавания паттернов, участвующих в распознавании вирусов системой врождённого иммунитета организма) у уток играет супрессорную роль в репликации вируса и инициирует провоспалительные пути, включающие сигналы интерферона I типа в местах заражения, и был предложен в качестве одного из ключевых путей, обусловливающих различия в чувствительности к вирусам птичьего гриппа между курами и утками. Поэтому остается неясным, приведут ли обычно более низкие титры РТГА после иммунизации ВПЧ (у уток по сравнению с курами) к более низким уровням защиты у уток.

Фактически, исследования Webster et al. продемонстрировали полную защиту от заражения вирусом HPAI H5N1 у вакцинированных уток с титрами РТГА значительно ниже, чем у цыплят, что указывает на то, что низкие титры антител РТГА не обязательно могут указывать на отсутствие защиты от вирусов HPAI у домашних уток. В конечном счете, крайне важно провести контрольные исследования как на курах, так и на утках с использованием нескольких клад вирусов HPAI H5, чтобы подтвердить расширенную защитную эффективность химерных ВПЧ и определить, соответствуют ли более низкие титры РТГА у уток снижению защитной эффективности.

Как текущие, так и предыдущие исследования продемонстрировали химерные ВПЧ в качестве многообещающей вакцинной платформы, обеспечивающей повышенную защитную эффективность против антигенно отдаленных вирусов гриппа у кур. В то время как эффективность химерных ВПЧ может различаться в зависимости от вида домашней птицы против HPAI, химерная вакцинная платформа с ВПЧ остается многообещающим подходом к борьбе с эпидемиями HPAI.

Будущие исследования будут включать сравнительные эксперименты по заражению вирусами, чтобы получить более полное представление о широкой защитной вакцинации, иммунитете видов носителей и различных патогенных механизмах вирусов птичьего гриппа у разных видов домашней птицы.

Химерная ВПЧ-вакцина, разработанная в этом исследовании, продемонстрировала индукцию высокого уровня широко реагирующих антител РТГА против различных вирусов H5 у иммунизированных кур, и аналогичную, но относительно более низкую реакцию, у уток. Эти данные свидетельствуют о том, что технология химерных ВПЧ перспективна в качестве платформы для борьбы с вирусами HPAI H5 Gs/GD-линии у домашней птицы. Кроме того, поскольку ВПЧ содержат только белки гемагглютининов и матрикса1 (M1), это позволит дифференцировать инфицированных вирусом птиц от вакцинированных, путем обнаружения антител к вирусному нуклеокапсиду, что предлагает многообещающую стратегию для дифференциации инфицированных животных от вакцинированных.