Пробоподготовка кишечного содержимого для ПЦР-мониторинга в стадах птиц

Как следует из нашего опыта, работа бактериологических лабораторий птицефабрик порой приносит больше вреда, чем пользы.

Во-первых, выделение не основной причины гибели птицы, а наиболее легко культивируемых микроорганизмов дезориентирует врача и приводит к назначению неактуальных антибиотиков. Во-вторых, многие бактерии могут быть выделены только от живой птицы, и доставка проб биоматериала в посторонние лаборатории часто сопровождается гибелью притязательных микроорганизмов (пастерелл, возбудителей гемофилеза и орнитобактериоза).

Из данных наблюдений можно сделать четыре вывода.

1. Наиболее надежным критерием эффективности антибиотиков является мониторинг их клинической эффективности на птицефабрике.
2. На крупных птицефабриках лабораторно-диагностические лаборатории необходимо развивать до общемирового уровня, работа лаборатории должна включать в себя элементы научно-исследовательской деятельности.
3. Именно вирусные агенты наиболее часто служат основной причиной развития массовых вторичных бактериальных инфекций, поэтому анализ эпизоотии бактериальной инфекции должен включать поиск возможных основных этиологических агентов вирусной природы.
4. Состав кишечной микробиоты, антагонистическая активность ингредиентных лактобактерий кишечника и отсутствие дисбиозов тоже нередко выступают наиболее значимым фактором, определяющим санитарную безопасность продуктов птицеводства в части наличия в них сальмонелл, клостридий и т. д.

Симбиотическая микрофлора составляет основу микроэкологии человека и животных. В микробном сообществе присутствуют представители сотен бактериальных видов, и это без учета простейших, низших грибов, вирусов и бактериофагов. Общее количество бактериальных клеток в кишечной микробиоте в 10–100 раз превышает общее количество клеток всех органов и тканей человеческого организма. К настоящему времени накоплено множество данных, свидетельствующих о важной роли микробиоты кишечника в жизненно важных процессах в организме животных и человека [3, 11, 13].

На основе накопленных знаний в ветеринарии и медицине в последнее время начало формироваться новое направление – целенаправленное воздействие на микробиом кишечника с целью коррекции ряда патологических состояний. В связи с этим требуется поиск способов направленного воздействия на кишечную микробиоту [4, 12, 14]. Оценка эффективности способов коррекции кишечной микробиоты требует, в свою очередь, соответствующей лабораторной базы и аналитических алгоритмов, позволяющих разрабатывать новые методы профилактики кишечных инфекций птицы.

Несмотря на высокий уровень чувствительности выделяемых нами культур сальмонелл к некоторым антибиотикам в лабораторных условиях, гарантировать 100 % адекватность результатов лабораторных исследований нельзя.

Проблема заключается в том, что в реальной практике антибиотик проявляет активность в окружении значительно большего числа микроорганизмов различных видов, чем в процессе микробиологических исследований. В лабораторных условиях практически невозможно воспроизвести реакцию организма курицы на возбудителя инфекционного заболевания. В связи с этим ПЦР-мониторинг сальмонеллеза можно считать наиболее адекватным и максимально приближенным к реальности методом контроля эффективности схем профилактики сальмонеллезов и сальмонеллоносительства.

Для сравнительной оценки эффективности различных ветеринарных схем профилактики сальмонеллеза у птиц в возрасте старше 20 дней (по завершении формирования микробиоты кишечника) можно сравнивать уровень инфицированности и / или инфекционную нагрузку до и после применения препарата / схемы лечения. Образцы кишечного содержимого нужно отбирать в количестве не менее 20, и обязательно до и после проведения антибиотикопрофилактики, причем чем ниже уровень инфицированности, тем больше проб нужно подготавливать для исследований.

Клоакальные смывы следует отбирать с помощью тампонов с транспортными средами типа Эймса или Стюарта (тампон после отбора должен содержать видимые остатки кишечного содержимого). Пробы, предназначенные для доставки в лабораторию, необходимо хранить в холодильнике при +5 °С не более недели (не замораживать!). Такой способ отбора проб подразумевает предварительное обогащение образца на пептонной воде, бульоне Шэдлера и последующую оценку уровня инфицированности птицы.

Второй вариант отбора проб подразумевает убой птицы (например, так удобно тестировать бройлеров). Обожженными ножницами на слепой кишке делается маленький надрез, и в одноразовую пробирку Эппендорфа выдавливается ~ 100–200 мкл содержимого кишки. Отбирают не менее 20 проб от каждой группы птиц (опытных и контрольных). Пробы заливают 96 % спиртом, хранят в морозильной камере, транспортировать их желательно при температуре ниже 0 °С (однако целостность ДНК сохраняется в течение 1–2 суток и при +3–5 °С). Такой метод позволяет оценить инфекционную нагрузку и процентный уровень инфицированности стада сальмонеллами. Также становится возможным проведение микробиомных исследований и обеспечиваются условия для выявления методом ПЦР наличия в пробах бактерий любых других видов.

В качестве эталонного теста мы можем рекомендовать REALPCR-набор IDEXX Salmonella spp. DNA-тест или иные широко распространенные в мировой практике тесты. Это позволит обеспечить сходимость результатов с данными других исследований, в том числе и зарубежных. Использование описанных в научной литературе «открытых» тестов, с известными структурами праймеров, помимо дешевизны обеспечивает больше возможностей для верификации результатов исследований (секвенирование ампликонов, рестрикция ампликонов и т. д.).

Рассмотрим методику проведения ПЦР в режиме реального времени на наличие Salmonella spp.

Геномную ДНК выделяют следующим образом.

В случае отбора клоакальных смывов рекомендуется провести предварительное их обогащение путем помещения тампона в питательные среды (например, в пептонный бульон, пептонный бульон с 10 % этиловым спиртом, RVS-бульон). Для этой цели асептично (обожженными ножницами) отрезают тампоны, помещают их в пробирки Эппендорфа и добавляют соответствующую питательную среду для обогащения. Пробирки инкубируют при +37–41 °С в течение 4–16 часов. Как показал наш опыт, инкубация образцов при +5–7 °С позволяла обеспечить бóльшую частоту детектирования сальмонелл и бóльшую концентрацию ДНК при проведении ПЦР.

После инкубации из пробирки следует отобрать 100 мкл культуральной жидкости для выделения ДНК и по 20–50 мкл пересеять на селективные питательные среды. В случае обогащения проб при низких температурах культивирование допустимо продолжить и выделять сальмонелл только из образцов, положительных в ПЦР.

Кишечное содержимое, залитое спиртом, центрифугируют, затем спирт удаляют и вносят в пробу лизирующий раствор в соотношении не менее чем 1 : 5.

Далее в 100 мкл суспензии бактерий нужно залить 0,3 мл 4М раствора гуанидинизотиоцианата, тщательно перемешать, инкубировать при +56 °С в течение 5–10 минут и центрифугировать при 10–12 тыс. об/мин в течение 3 минут. Надосадочную жидкость переливают в другие пробирки и туда же вносят по 50 мкл ДНК сорбента (silica). В качестве альтернативного сорбента можно использовать синтетическую окись кремния Ковелоссорб. Пробы тщательно перемешивают, инкубируют в течение 5 минут при периодическом перемешивании и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость сливают, сорбент промывают буфером для промывки А2 (300 мкл) однократно и буфером для промывки А3 (500 мкл 75 % этилового спирта) двукратно. Полученную ДНК высушивают при +50–60 °С.

Подготовленные таким образом пробы хранят при температуре минус 18 °С в высушенном виде. Транспортировать их можно при комнатной температуре. Для проведения реакции ДНК следует элюировать 70 мкл ТЕ буфера при +56 °С и центрифугировать при максимальных оборотах на протяжении 5 минут.

Реакцию учитывают общепринятым методом с использованием real-time амплификатора на основании калибровочных кривых, полученных с использованием стандартных образцов с различным содержанием микроорганизмов в пробе [8].

С целью оценки эффективности антибиотикотерапии мы рекомендуем проводить отбор биоматериала непосредственно до ее начала и сразу после отмены.

Группа	Срок отбора проб для анализа	Объем выборки, абс. число проб	Уровень инфициро- ванности, %
1	До проведения антибиотикотерапии	10	20
2	До проведения антибиотикотерапии	10	30
3	До проведения антибиотикотерапии	10	20
4	До проведения антибиотикотерапии	21	19,04
1	После проведения антибиотикотерапии (Флубактин)	10	0
2	После проведения антибиотикотерапии (Энроксил)	10	0
3	После проведения антибиотикотерапии (Энроксил)	10	0
4	После проведения антибиотикотерапии (Эгоцин)	21	0

Исследования показали, что уровень инфицированности с 19,04 % к окончанию курса антибиотикопрофилактики снизился до 0 %, однако через 7 дней вновь вырос до 4,7 %.

В другом эксперименте, производственном, по результатам ПЦР-анализа клоакальных смывов мы наблюдали снижение инфицированности сальмонеллами цыплят-бройлеров (табл. 2).

№ п/п	Срок отбора проб для анализа	Уровень инфицированности, %	Объем выборки, абс. число проб
1	До применения противосальмонеллезного бактериофага	15	20
2	После применения противосальмонеллезного бактериофага	10	20
3	—	15	20
4	После применения противосальмонеллезного бактериофага	5	20
5	—	20	20
6	—	15	20
Итого			120

Помимо определения степени инфицированности на популяционном уровне с помощью real-time ПЦР может быть оценена инфекционная нагрузка сальмонеллами контаминированной ими птицы.

Обобщая результаты экспериментов с различными препаратами за последние годы, мы фиксировали существенное снижение инфицированности сальмонеллами при использовании пробиотиков (L. reuteri), бактериофагов, кормовых антибиотиков и, в меньшей степени, некоторых антибиотиков и препаратов органических кислот [1].

В качестве примера «открытых» тестов, используемых для ПЦР-мониторинга эффективности ветеринарных препаратов и профилактических схем в стадах птиц, в табл. 3 указаны структуры праймеров и зондов.

Возбудитель	Олигонуклеотиды (праймеры, зонды)	Температура отжига праймеров, особенности теста	Отсылки к публикациям
Salmonella enterica	sm1b 5′- atgggagcatattctggtagcaagt-3′ sm3u 5′-atggtcaaggctggaggaagtgact-3′ SM2 R6G5′-ttattcgcaaagggatccgtcagacc-3’BHQ+	65-66 °C по 40 секунд	[1, 8]
E.coli	Ec1 5′-gcagtcaattggtagcgtc-3′, Ec 2 5′-cagcttctttggcatgaa-3′, Ec3 R6G 5′-tttcgccgatctgaagagcttacc-3′ BHQ+	58-59 °C	[6]
C.perfringens	Cpf 1 5′-cacgtgctctaccgagt-3′ Cpf 2 5′-acatggttcagctgaccgatac-3′ Cpf 3 5′ FAM-catcggtcttcaaaggctaaaccgtc-BHQ+	60,75 °C по 1-1,5 минуты	[6, 9]
Chicken parvovirus	ChPV-R 5′-atatcactcaagtttcaagcag-3′ ChPV-U 5′-ttttcaggagactatcaccg-3′	+59,6 °C	—
Тест для контроля степени деградации РНК кур	Burg2 5-acttacccgaccttctcat Burg1 5-cgtgaccccgacaaactcaa Burg3 R0X-5-tgggactcactggttctacc-3′ BHQ2	59-65 °C	—
Вирус ИБК	IBV5′-atgtcctaacctttgccctaga-3′ IBV 5’tcaaactcggcatcatcagt-3′, IBV FAM-tggaagtagagtgacgcccaaa-BHQ,+	60 °C	[7]

Ориентировочный состав реакционной смеси: 60 mM Tris-HCl (pH 8,5 при 25 °С); 1,5 mM MgCl2; 25 mM KCl; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон Х-100; 0,3 мкМ праймеров; 0,1 мкМ концентрация Taqman зонда; 1 ед. HS-Taq-ДНК полимераза (Биолабмикс); 0,2–0,3 мМ dNTP.

Ориентировочная программа амплификации: +95 °С горячий старт 6–9 мин (денатурация +95 °С – 15 с, отжиг).

Заключение

Предложенный комплекс тестов необходим в первую очередь для ПЦР-мониторинга эффективности ветеринарных мероприятий и разработки новых схем профилактических обработок сельскохозяйственной птицы. В связи с этим интерпретация результатов ПЦР-диагностики целесообразна только в контексте сравнительного анализа опытных и контрольных групп птиц.

Библиографические ссылки

1. Анализ системы планирования противосальмонеллезных мероприятий на птицефабриках / В. Н. Афонюшкин, Ю. С. Хоменко, О. А. Фролова [и др.] // Птица и птицепродукты. 2019. № 3. С. 20–23.
2. Антагонистическая активность лактобактерий из кишечника сельскохозяйственной птицы в отношении клинических изолятов Salmonellaenterica / В. Н. Афонюшкин, И. Н. Троменшлегер, М. Л. Филипенко [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2016. Т. 161, № 6. С. 757–760.
3. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01. Приложение 1 / Минздрав России. Москва, 2002. // Гарант.ру Информационно-правовой портал URL: https://base.garant.ru/4178234/#friends (дата обращения: 11.03.2021).
4. Изучение защитных эффектов вироцидных препаратов на модели коронавирусной пневмонии / Т. Е. Миронова, В. Н. Афонюшкин, Ю. Н. Козлова [и др.] // Ветеринария и кормление. 2020. № 7. С. 35–38.
5. Изучение инфицированности печени и кишечника Clostridiumperfringens у кур с использованием полимеразной цепной реакции / В. Н. Афонюшкин, В. С. Черепушкина, А. С. Киревичева [и др.] // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2015. № 4 (245). С. 81–86.
6. Изучение противовирусного действия препарата тривирон на возбудителя инфекционного бронхита кур / В. Н. Афонюшкин, А. Н. Ширшова, Д. В. Шамовская [и др.] // Ветеринария. 2018. № 7. С. 24–28.
7. Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов : Методические рекомендации / В. Н. Афонюшкин, Т. В. Сподырева, Ю. Г. Юшков [и др.] ; Россельхозакадемия [и др.]. Новосибирск, 2011. 63 с.
8. Разработка тест-системы для выявления Clostridium perfringens / В. С. Черепушкина, Ю. С. Хоменко, К. А. Табанюхов, В. Н. Афонюшкин // Аграрная наука – сельскому хозяйству : сборник статей. В 3 книгах. Книга 3. Барнаул : АГАУ, 2016. С. 298–299.
9. Современные методы контроля сальмонеллеза / В. Н. Афонюшкин, Е. В. Дударева, Л. И Малахеева [и др.]. // Птицеводство. 2008. № 9. С. 43–44.
10. Указание по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения. Утверждены Приказом Департамента ветеринарии от 4 октября 1999 г № 12-7-1/900 // URL: http://gov.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/451.html (дата обращения: 11.03.2021).
11. Фисинин В. И. Птицеводство в России в 2011 году: состояние и перспективы инновационного развития до 2020 года // Материалы XVII Международной конференции «Инновационные разработки и их освоение в промышленном производстве». Сергиев Посад, 2012. С. 7–17.
12. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria / D. L. Smith, A. D. Harris, J. A. Johnson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, nr 9. P. 6434–6439.
13. Fuller R. Probiotics in man and animals // J. Appl. Bacteriol. 1989. Vol. 66, nr 5. P. 365–378.

Авторы:
В. С. Черепушкина, младший научный сотрудник сектора молекулярной биологии Сибирского федерального центра агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН), Новосибирск
А. С. Бобикова, младший научный сотрудник сектора молекулярной биологии СФНЦА РАН, аспирант кафедры акушерства, анатомии и гистологии федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования «Новосибирский государственный аграрный университет» (ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ), Новосибирск
Т. Е. Миронова, младший научный сотрудник сектора молекулярной биологии СФНЦА РАН, аспирант ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ, Новосибирск
Н. В. Давыдова, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник сектора молекулярной биологии СФНЦА РАН, Новосибирск
В. Н. Афоношкин, кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной биологии СФНЦА РАН, сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск
К. Д. Демидова, лаборант сектора молекулярной биологии СФНЦА РАН, Новосибирск

Источник: Журнал БИО